防治奶牛乳腺炎的抗微生物藥
靶動物安全性和有效性試驗指導原則

一、概述

（一）目的

為指導申報單位開展抗微生物藥物防治奶牛乳腺炎的安全性和有效性研究，特制定本指導原則。

（二）適用范圍

適用于通過乳房灌注給藥防治奶牛乳腺炎的制劑。

（三）術語

乳腺炎（Mastitis）：通常是由一種或多種病原微生物引起的乳腺炎癥，以乳腺上皮細胞發生病理學改變為特征，繼而出現炎癥反應和分泌變化，受感染乳區白細胞增多。

臨床型乳腺炎（Clinical infectious mastitis）：1個或多個乳區有臨床癥狀（腫脹、發熱、痛感、潮紅）且乳汁外觀改變（凝乳塊或絮狀物、水樣外觀，顏色變化），并伴有或無一般臨床癥狀（發熱、食欲減少）的乳腺炎。

亞臨床型（隱性）乳腺炎（Sub-clinical infectious mastitis）：乳腺炎的一種形式，乳房和乳汁肉眼觀察無異常，但乳汁理化性質發生變化，乳汁體細胞數明顯增加，且細菌學培養存在病原微生物。

體細胞定量計數（Quantitative somatic cell count，QSCC）：利用庫氏計數器或電子體細胞計數技術等測定乳汁中的體細胞數。

二、防治乳腺炎產品的靶動物安全性試驗（刺激性試驗）

（一）概述

申報單位必須證明擬上市的用于防治奶牛乳腺炎的產品對靶動物是安全的。下述的安全性試驗用于證明受試藥對靶動物的安全性。另外，在療效試驗期間，藥物發生的任何不良反應也應予以報告。

（二）受試動物

1. 用于泌乳期的獸藥

選擇健康無乳腺炎的經產奶牛和初產奶牛各6頭，每組應有半數奶牛（3頭）的日產奶量在25kg以上（泌乳早期）、半數奶牛（3頭）的日產奶量在15kg以下（泌乳后期）。

對每頭受試動物應說明其年齡、泌乳階段、擠奶次數以及日產奶量情況。

2. 用于干乳期的獸藥

選擇6頭正常經產奶牛（已完成2次及2次以上泌乳的經產奶牛）和6頭初產奶牛（完成第一個哺乳期的初產奶牛）。

對每頭受試動物應說明其年齡、擠奶次數方面的情況。對經產奶牛要說明前一個泌乳期的產奶量。

（三）受試藥物

擬用于防治奶牛乳腺炎的制劑。

（四）給藥與采樣

1. 給藥前

給藥前至少間隔24小時連續2次采集每頭牛的4個乳區奶樣，分別進行細菌培養鑒定和體細胞定量計數，以確定受試動物是否健康。

2. 給藥

在第2次采樣后間隔24小時開始按照標明的藥物給藥方案給藥，且每頭牛的4個乳區均需給藥。

3. 給藥后采樣

（1）泌乳期產品

對于多次給藥的產品，自第二次給藥開始，每次給藥前采集每頭牛的四個乳區奶樣，進行體細胞定量計數。并分別在最后一次給藥結束后12小時和第7天采樣進行細菌培養和體細胞定量計數。

（2）干乳期產品

分別于給藥結束后12小時和第7天采集每頭牛的4個乳區奶樣，進行細菌培養和體細胞定量計數。

（五）數據收集與結果評價

一般性信息：包括動物身份的識別信息、試驗地點、試驗編號、觀察日期、測試天數和時間，以及每個受試牛的產奶量和體溫。

一般臨床觀察：每天2次，對每頭牛的4個乳區進行檢查，并進行觸診，以表明有無腫脹、潮紅和疼痛等反應；另外，在每個階段還要通過定量計數方法測定體細胞數。

根據所收集的上述數據及臨床檢查結果確定防治乳腺炎產品對靶動物的安全性。

三、防治乳腺炎產品的藥物有效性研究

（一）一般性原則

對治療臨床型乳腺炎的藥物，其用藥條件是：動物應存在某種入侵乳房的病原菌、有細胞學反應且牛奶出現異常，或者出現臨床癥狀（如腫脹、潮紅和痛感），或者兩者同時存在。對治療亞臨床型乳腺炎的藥物，其用藥條件是：動物應存在某種入侵乳房的病原菌和有細胞學反應。

在臨床研究中，乳腺炎致病菌分布情況將用于確定標簽的療效說明。這需要有足夠數量的主要乳腺炎致病菌以證明其有效性。

應報告體細胞定量計數結果。該信息將用于檢查在各治療組內“治愈”和“未治愈”奶牛體細胞定量計數平均值之間的變化趨勢。

數據收集應來自具有代表性的靶牛群。為此應對靶牛群中所有泌乳或非泌乳奶牛（取決于標簽說明中擬用的適應證）進行檢查，所有符合條件的奶牛（被感染的奶牛）都應入選至試驗中。

應提交牛群/奶牛的一般性描述數據，這些數據包括整個成年牛群的大小、當前泌乳的奶牛數、牛群中被取樣的泌乳奶牛數和百分率、感染乳腺炎的泌乳奶牛數和百分率、每頭奶牛的大致年齡、品種、當前日產奶量、泌乳次數和泌乳階段。

在進行亞臨床型傳染性乳腺炎研究時，建議試驗前進行細菌培養/取樣調查。試驗前的培養或取樣檢查應包括來自整個牛群中所有泌乳奶牛的全部乳區的奶樣，牛群中所有感染乳區應包括在研究中。

確定治療臨床型乳腺炎的復方產品療效則應按目前對復方藥物的要求進行研究，建議申報單位在研發這類產品前有必要對提交數據的要求以及特定復方產品的優點進行分析討論。

入選的受試動物應無相關抗乳腺炎疫苗的接種史。這些產品包括但并不局限于疫苗、菌苗、免疫調節劑、血清抗體或抗毒素等。

供臨床試驗的牛群必須有足夠數量的臨床乳腺炎病例以滿足對各組的動物數要求。在開始研究前應詳細說明（規定）牛群數和在每個牛群的分組情況。

建議采用盲法研究，并提供所用盲法的詳細情況。

（二）臨床試驗

1. 劑量篩選試驗（Ⅱ期臨床試驗）

包括一個對照組和至少3個藥物劑量組，其中3個藥物劑量組由一個不十分有效的較低劑量組、一個推薦劑量組和一個較高但并不比推薦劑量更有效的劑量組組成。劑量篩選試驗應至少在兩個奶牛場執行。每個奶牛場每組動物不少于15頭。

2. 劑量確認試驗（Ⅲ期臨床試驗）

以劑量篩選試驗中確定的有效劑量為基礎，試驗設計時必須包含一個對照組，最好是陰性對照組。如果未使用陰性對照研究應說明理由。對于原創藥物，由于我國各地氣候和地域地理條件不同，劑量確認試驗應至少在兩個地區（南方、北方各一個）進行，并由不同的研究機構實施。每個地區每組動物不少于30頭。

3. 評價參數

評價藥物有效性的關鍵參數是用藥后的臨床反應和細菌學培養結果。研究人員應參照奶牛乳腺炎診斷的微生物學程序進行細菌學培養和鑒定。

（三）用于泌乳期奶牛臨床型乳腺炎的獸藥

1.動物入選標準

（1）試驗動物以患有臨床型乳腺炎的泌乳期奶牛（如含有凝乳塊、絮狀物及水樣外觀的視覺異常乳和/或乳房出現如腫脹、潮紅和痛感的臨床癥狀）為單元。一般只有單個乳區患有臨床型乳腺炎的奶牛才能被登記用于試驗。

（2）在登記入選奶牛時需對臨床型乳腺炎（如是否有凝乳塊、絮狀物、水樣外觀的異常奶，和/或乳房出現腫脹、發紅和疼痛的臨床癥狀）進行診斷。臨床型乳房炎由研究者在采樣時做出診斷，但在其他時間可由奶牛場的獸醫進行評估。

2. 治療前采樣（研究者在治療前應對牛群進行篩選，以使感染某一病原菌的牛在各治療組中均勻分配）

（1）在治療前采集一份乳樣進行微生物學檢查和體細胞定量計數。測定分離的乳腺炎病原菌最小抑菌濃度（MIC）和MIC臨界點，以評估病原菌對新的抗感染藥物的敏感性。

（2）采樣時應對來自受試乳區的乳樣進行臨床型乳腺炎癥狀（如凝乳塊、絮狀物、水樣外觀的異常奶）檢查。每次擠奶時將陽性結果記錄在動物的數據記錄表中，并與每次擠奶時的日常檢查收集的數據進行匯總。

3. 治療

只有單個乳區感染的奶牛才被用于治療試驗。在入選試驗期間，若奶牛的其它非用藥乳區發生乳腺炎，則從試驗中剔除該奶牛，但不認為是治療失敗。在評估療效時應剔除對其他炎癥乳區要求和/或接受治療的奶牛。對照選擇包括：試驗前后對比、與已批準的對照藥物治療對比。

4. 治療后采樣

在療效評估期間（治療后14～28天）各用藥的乳區至少要采集2次乳樣，并對每份乳樣分別進行微生物學檢測和體細胞定量計數。2份乳樣間的采樣間隔時間至少為7天。

5. 療效的評估

（1）根據給藥后7～14天之間對照組的試驗結果評價治愈情況。只有在治療前從乳樣中分離出乳腺炎病原菌的臨床型乳腺炎病例才能用于計算治愈率。體細胞定量計數僅作為檢查各治療組內“治愈”和“未治愈”奶牛的平均體細胞數之間的變化趨勢。

（2）治愈標準：臨床上治愈的乳區必須泌乳正常、無臨床型乳腺炎癥狀，且在微生物學分離培養上，治療前乳樣中分離出的乳腺炎病原菌在治療后采集的奶樣中不得再分離出。

（3）來自臨床研究的乳腺炎病原菌分布情況將用于確定標簽的療效說明。例如，對葡萄球菌和鏈球菌性乳腺炎病原菌有效的抗微生物藥適應證是：“用于治療由葡萄球菌屬（如金黃色葡萄球菌）和鏈球菌屬（如無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌）細菌引起的臨床型乳腺炎”。

（四）用于泌乳期奶牛亞臨床型乳腺炎的獸藥

所有防治泌乳期奶牛乳腺炎的抗微生物藥必須對臨床型乳腺炎有效，一般不會單獨批準僅用于防治泌乳期奶牛亞臨床型乳房炎的產品。要獲得治療亞臨床型乳腺炎的適應證，則需要另外提供亞臨床型乳腺炎的試驗數據。

1. 動物入選標準

選擇陽性乳區（感染）的奶牛用于亞臨床型乳腺炎治療試驗。研究者在采樣前應對牛群進行篩選以盡可能使病原菌在各治療組中平均分配。

2. 治療前采樣

治療亞臨床型乳腺炎產品的研究將是一種隨機化研究。在治療前要求獲得2份微生物學和體細胞定量計數檢測樣本，采樣間隔時間至少24小時。

3. 治療

在亞臨床研究中，對任何奶牛只治療一個乳區。對存在多個乳區感染的奶牛，將隨機選擇其中的一個感染乳區進行治療，其他乳區不用藥治療。如果其他乳區因臨床型乳腺炎而要求額外治療時，則應從研究中剔除該奶牛。

4. 治療后采樣

在治療后14～28天內，采集2次乳樣用于微生物學和體細胞定量計數檢測。2份乳樣的采樣間隔時間至少為7天。

5. 治愈的評價標準

（1）在治療后7～14天期間根據陰性對照組研究結果評估治愈情況。在亞臨床治療研究中，體細胞定量計數結果如臨床研究一樣只用于檢查體細胞數的變化情況。

（2）治療前從乳樣中分離出的乳腺炎病原菌在治療后采集的乳品中應不得再檢出。

（3）依據亞臨床研究中獲得的有效數據，產品將得到類似下面的適應證說明：用于治療由葡萄球菌屬（如金黃色葡萄球菌）、鏈球菌屬（如無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌）細菌引起的臨床和亞臨床型乳腺炎。

（五）用于干乳期奶牛亞臨床型乳腺炎的藥物

對擬用于干乳期的藥物，有必要分別進行治療和預防效果研究。治療將意味著消除干乳期奶牛中已有的感染，而預防則意味著防止干乳期奶牛出現新的感染。

對預防性用藥，有必要通過陰性對照組確定新感染比率。

1. 動物入選標準

將進入泌乳后期準備干奶的奶牛納入試驗研究中。

2. 給藥前采樣

研究者在治療前1周應從每個乳區采集2次乳樣用于微生物分離培養，2次乳樣的采樣間隔至少為24小時，其中第二份樣品在預期干奶的當天采集。其中一份來自給藥前的奶牛每個乳區的奶樣用于測定體細胞定量計數。

3. 給藥

用于干乳期治療和預防的藥物，入選奶牛的所有乳區應在第二次乳樣采集后通過乳房灌注給藥。

4. 給藥后采樣

用于干乳期治療和預防的藥物，應在奶牛產犢后1～5天內從每個乳區采集兩次樣品用于細菌分離培養，兩次采樣間隔應為24小時。同時測定每個乳區第2份奶樣的體細胞定量計數。

5. 療效的評價標準

（1）對于治療藥物：在再次泌乳時微生物培養應為陰性且無臨床癥狀。

（2）對于預防藥物：陽性對照組的，受試藥的預防效果應不顯著低于陽性對照組的療效；設陰性對照組的，則受試藥組的新增感染率至少降低50%。

（3）體細胞定量計數的結果只用于臨床研究中檢查體細胞數的變化情況。

四、療效的判定標準

以下各表所示的給藥前和給藥后細菌學分離培養結果是本文中所述的采集一份或2份乳樣的檢測結果。這些組合可外推至其他病原菌。

（一）用于泌乳期奶牛的產品

表1 臨床型乳腺炎治療結果

注釋：

1. 對于傳染性乳腺炎病原菌（金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌），只要有一份樣品出現陽性培養結果，動物即可入選試驗中，對于其他病原菌，給藥前的2份樣品連續培養均必須為陽性的動物才可入選試驗研究。

2. 對于所有病原菌，在治療后只要有一份樣品出現陽性培養結果（與治療前樣品中分離培養出的細菌相同），即為治療失敗。

3. 金黃色葡萄球菌。

4. 無乳鏈球菌。

5. 在給藥前分離出一種病原菌而在給藥后分離出另一種不同病原菌的病例應予以記錄；這種事件的發生率在最終的試驗報告表中應給予表述。

注：應在原始數據表中記錄給藥前和給藥后乳汁異常跡象和乳腺炎的臨床癥狀。

表2 亞臨床型乳腺炎治療結果

注釋：

1. 對于傳染性乳腺炎病原菌（金葡菌和無乳鏈球菌），只要有一份樣品出現陽性培養結果動物即可入選試驗中，對于其他病原菌，給藥前的兩份樣品連續培養均必須為陽性的動物才可入選試驗研究。

2. 對于所有病原菌，在治療后只要有一份樣品出現陽性培養結果（與治療前樣品中分離培養出的細菌相同）即為治療失敗；

3. 金黃色葡萄球菌；

4. 無乳鏈球菌；

5. 在給藥前分離出一種病原菌而在給藥后分離出另一種不同病原菌的病例應予以記錄；這種事件的發生率在最終的試驗報告表中應給予表述。

（二）用于干乳期乳腺炎的藥物

表3  治療干乳期亞臨床型乳腺炎結果

注釋：

1. 對于傳染性乳腺炎病原菌（金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌），只要有一份樣品出現陽性培養結果，動物即可入選試驗中，對于其他病原菌，給藥前的2份樣品連續培養均必須為陽性的動物才可入選試驗研究。

2. 對于所有病原菌，在治療后只要有一份樣品出現陽性培養結果（與治療前樣品中分離培養出的細菌相同），即為治療失敗。

3. 金黃色葡萄球菌。

4. 無乳鏈球菌。

5. 在給藥前分離出一種病原菌而在給藥后分離出另一種不同病原菌的病例應予以記錄；這種事件的發生率在最終的試驗報告表中應給予表述。

表4  預防干乳期亞臨床型乳腺炎結果

注釋：

1. 對于預防適應證，所有給藥前的細菌培養結果應為陰性。

2. 對于所有病原菌，在治療后只要有一份樣品出現陽性培養結果（與治療前樣品中分離培養出的細菌相同），即為治療失敗。

3. 金黃色葡萄球菌。

4. 無乳鏈球菌。

注：

1. 傳染性的亞臨床型乳腺炎的預防效果應能使新感染至少應下降50%；

2. 應測定一份來自給藥前乳樣的體細胞定量計數。

 來源：獸藥評審中心

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